Phasenkontrast und Informationslimit

Jede Linsenabbildung kann mathematisch als eine Fouriertransformation von der vorderen in die hintere Brennebene dargestellt werden. Die Ortskoordinaten werden dabei in die sogenannten Raumfrequenzen (Kehrwerte der Ortskoordinaten) transformiert. Das bedeutet, kleinen Abständen im Objekt entsprechen große Raumfrequenzen und umgekehrt.

Bei der Abbildung dünner amorpher Objekte im Transmissionselektronenmikroskop erfährt der Elektronenstrahl durch die Atome der zu untersuchenden Probe nur Phasenverschiebungen. Diese führen noch nicht zu einer Bildentstehung. Erst die Überlagerung der ungestörten Welle mit der Streuwelle führt zu Interferenzeffekten und damit zu messbaren Intensitätsschwankungen im Bild. Optimalen Kontrast erhält man für eine Phasenschiebung von ±π/2 zwischen gestreuter und ungestörter Welle. In der Lichtmikroskopie erzeugt man diese durch sogenannte Phasenplatten.

Im unkorrigierten Elektronenmikroskop entsteht allein aufgrund der Linsenfehler eine Phasenschiebung des Elektronenstrahls. Den Hauptbeitrag liefert der Öffnungsfehler. Bei der Abbildung eines Punktes (Deltafunktion) verursacht die Linse Phasenunterschiede zwischen ungestreuten und gestreuten Elektronen von

(1)Formel1

k bezeichnet die Raumfrequenz, cs den Öffnungsfehlerkoeffizient und Δf den Defokus. Das bedeutet, die resultierende Wellenfunktion hat die Form:

(2)Formel2

Der Imaginärteil dieser Funktion liefert die Phasenkontrastübertragungsfunktion für schwache Phasenobjekte. Die Amplitude A0 setzt sich zusammen aus der maximal übertragbaren Raumfrequenz, die durch die Objektivaperturblende gegeben ist und der Dämpfung der Wellenfunktion durch die begrenzte Kohärenz. Man kann sie darstellen als Produkt der Blendenfunktion A1 und der Dämpfungsfunktion A(k), wobei die Blendenfunktion gegeben ist durch:

A1 = 1 für k<kmax und A1 = 0 für k≥kmax

wenn kmax die größte übertragbare Raumfrequenz ist.

Kontrastübertragungsfunktion als Funktion der Raumfrequenz k, ohne Dämpfung

Bild1

verwendete Parameter: λ=0.0025 nm (200 kV), cs =1.1 mm, Δf=60 nm

Jedem Nulldurchgang der Kurve entspricht im Objektbild eine Kontrastumkehr. Bis zum ersten Nulldurchgang k0 (im Bild etwa 4.1/nm) ändert der Kontrast sein Vorzeichen nicht. Der Kehrwert 1/ k0 wird als die Scherzersche Punktauflösung bezeichnet (sie entspricht im Diffraktogramm dem Radius des ersten dunklen Ringes). Den Wert des Defokus, bei dem - bei gegebenem Öffnungsfehler - die Punktauflösung möglichst groß wird, bezeichnet man als Scherzerfokus. Soange man im Scherzerfokus arbeitet, wird ein breites Band an Raumfrequenzen mit gleichbleibendem Kontrast übertragen und ermöglicht so eine klare Interpretation des erhaltenen Bildes.

Sein Wert lässt sich abschätzen zu

(3)Formel3

damit ergibt sich die Punktauflösung zu

(4)Formel4

Kontrastübertragungsfunktion als Funktion der Raumfrequenz k, mit Farbfehler

Da jede Elektronenquelle eine endliche Energiebreite hat, erfahren die Elektronen durch den Farbfehler verschiedene Phasenschiebungen, wenn sie die Objektivlinse passieren. Die maximal mögliche Phasenschiebung ergibt sich durch die Energiebreite der Quelle

(5)Formel5

Daraus resultiert eine Dämpfung der Phasenkontrastübertragungsfunktion

(6)Formel6

Bild2

verwendete Parameter: λ=0.0025 nm (200 kV), cs =1.1 mm, cc =1.6 mm, Δf=60 nm, ΔE=0.7 eV, E=300 kV

Durch die Dämpfung infolge des Farbfehlers wird die maximal übertragbare Raumfrequenz begrenzt. Sie ist der Kehrwert des kleinsten räumlichen Abstandes im Objekt, der noch übertragen werden kann. Dieser Abstand wird als Informationslimit bezeichnet, definitionsgemäß erleidet der Kontrast für die entsprechende Raumfrequenz eine Dämpfung von 1/e2 (im Bild als wagrechte Linie dargestellt) im Vergleich zum ungedämpften Fall. In unserem Fall liegt es bei etwa (1/8.3) nm.

Durch die Korrektur von Öffnungs- UND Farbfehler optimiert man das Informationslimit, es werden noch kleinere Objektdetails sichtbar. Die folgenden Bilder zeigen berechnete Diffraktogramme, beim linken wurde der Öffnungsfehler korrigiert, beim rechten sowohl Öffnungs- als auch Farbfehler. Die Moirémuster sind Artefakte der Bildschirmrasterung.

Bild4aBild4b

Vorteil der Öffnungsfehlerkorrektur

In jedem unkorrigierten Elektronenmikroskop ist die erreichbare Punktauflösung viel schlechter als das optimale Informationslimit. In einem korrigierten Mikroskop kann man den Öffnungsfehlerkoeffizienten und den Defokus so optimieren, dass die Punktauflösung gleich dem Informationslimit wird.

Das erreichbare Informationslimit ergibt sich anhand des Farbfehlers (siehe Darstellung der Kontrastfunktion mit Dämpfung). Dann kann man den entsprechenden Öffnungsfehlerkoeffizienten durch Gleichung (4) bestimmen. Es ergibt sich für den hier betrachteten Fall cs=0.080 mm. Mit diesem Wert kann der optimale Defokus an Hand von Gleichung (3) zu 17.01 nm bestimmt werden.

Die folgende Abbildung zeigt die sich daraus ergebende Phasenkontrastübertragungsfunktion:

Bild4

verwendete Parameter: λ=0.0025 nm (200 kV), cs =0.159 mm, cc =1.6 mm, Δf=23.92 nm, ΔE=0.7 eV, E=300 kV

Die Öffnungsfehlerkorrektur erlaubt es demnach, die Punktauflösung so stark zu erhöhen, dass sie mit dem Informationslimit übereinstimmt, hier etwa (1/8.3) nm = 0.12 nm.

Begrenzung bei kleinen Raumfrequenzen: Phasenplatten als Alternative

Die Phasenkontrastübertragungsfunktion zeigt, dass die Korrektur von Öffnungs- und Farbfehler es ermöglicht, die Punktauflösung zu höheren Ortsfrequenzen hin zu verschieben. Dennoch zeigen sowohl im korrigierten als auch im unkorrigierten Mikroskop Raumfrequenzen unterhalb von 1/nm keinen Phasenkontrast. Das Verhältnis zwischen der höchsten und der niedrigsten Raumfrequenz, die deutlichen Phasenkontrast zeigen, liegt weit unter 10.

Was das für die Abbildungsqualität der untersuchten Probe bedeutet, zeigen die folgenden simulierten Bilder eines makroskopischen Objektes. Wir nehmen an, das Bild zeige ein mikroskopisches Phasenobjekt der Größe 16x16 nm. Die weiße Farbe repräsentiert eine Phasenschiebung von π/10 und durch schwarz wird die Phasenschiebung Null dargestellt. Das Bild zeigt also ein schwaches Phasenobjekt.

Wenn ein solches Objekt mit der Phasenkontrasttransferfunktion (PCTF) eines unkorrigierten Mikroskops abgebildet wird, ist das Ergebnis sehr enttäuschend. Die Grobstruktur der Probe kann kaum erkannt werden. Nur die Kanten des Objekts sind sichtbar, die niedrigen Frequenzkomponenten dagegen gehen verloren und es entstehen etliche Artefakte. Doch selbst für die PCTF eines Cs korrigierten Mikroskops zeigt das Bild nur die Feinstruktur der Probe. Die Anzahl der Artefakte im Bild ist jedoch deutlich reduziert. Jedwede gröbere Struktur geht aber infolge des cut-off für niedrige Frequenzen verloren. Dies ist für viele Anwendungen in der Materialwissenschaft kein Problem, da dort langreichweitige Phänomene weniger wichtig sind, aber für die Life sciences ist ein cut-off von etwa 1 nm kritisch.

Imaging with phase contrast
Phasenkontrastabbildung eines original schwachen Phasenobjektes in einem unkorrigierten und einem Cs-korrigierten Mikroskop und mit einer Boersch- oder einer Zach-Phasenplatte.

Um dieses Hindernis zu beseitigen wurden Phasenplatten entwickelt. Ihre Funktion beruht darauf, dass die Phase der ungestreuten Elektronen, des sogenannten Nullstrahls, relativ zur Phase der gestreuten verschoben wird. Elektronen mit unterschiedlichen Streuwinkeln passieren die Beugungsebene an unterschiedlichen Stellen. Erzeugt man in dieser Ebene eine Spannung, die nur auf den Nullstrahl wirkt, so kann die gewünschte Phasenschiebung eingestellt werden. Wenige Millivolt Spannung genügen, um eine Phasenverschiebung von π/2 zu erzielen.

Eine Boersch-Phasenplatte (Bild aus KIT) und eine Zach-Phasenplatte (Bild aus Katrin Schultheiss's Diss (12MB Gesamttext, sehr interessant!))

Eine mögliche Methode ist die Anwendung der sogenannten Boersch-Phasenplatte: Eine nur mikrometergroße Struktur wendet die Spannung in der kleinen Bohrung der Phasenplatte nur an dem ungestreuten Strahl, der diese zentrale Öffnung passiert, an. Die gestreuten Elektronen merken davon nichts. Eine Variante dieser Phasenplatte ist die sogenannte Zach-Phasenplatte, wie sie von CEOS patentiert wurde. In diesem Fall wird die Spannung im Kern einer Koaxialstruktur angelegt, die sich den ungestreuten Elektronen von einer Seite nähert. So wird die Abschattung von Elektronen mit kleinen Streuwinkeln vermieden, wie sie bei der ringförmigen Struktur der Boersch-Phasenplatte auftritt.

Wie man an dem Bild sehen kann, würden solche Phasenplatten die Abbildung von niederfrequenten Anteilen sehr deutlich verbessern. Auf diese Weise entsteht ein viel realistischeres Bild der originalen Ausgangswelle der Probe.

Auf der ganzen Welt arbeiten einige Gruppen daran, effiziente Phasenplatten herzustellen und sie zum Abbilden zu verwenden. Für weitergehende Informationen können Sie die folgenden links verwenden:

Phase plate development at the Karlsruher Institut für Technologie

An article about phase plates for biological applications in bioPHOTONICS

Einige Originalarbeiten zum Thema Phasenplatten sind in unserer Literaturliste zu finden.



Dieser Artikel entstand in Anlehnung an eine Praktikumsanleitung zur Transmissionsmikroskopie der Uni Dresden sowie den englischsprachigen Wikipediabeitrag über hochauflösende Transmissionmikroskopie.

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